负染色技术是一种制备电子显微镜样品图像呈现复反差的技术。用于观察样品中的颗粒性物质或生物大分子。用金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。目前最常用的负染液是醋酸铀或者磷钨酸。
在负染色技术中，主要步骤包括：
1. 样品准备：首先，将稀释后的生物样品滴在载网上，通常是涂布在一个网格状的铜或镍网上的小洞（也称井）内。
2. 负染色剂添加：随后迅速滴加一种高电子密度的染色剂，如磷钨酸（Phosphotungstic acid, PTA）、醋酸铀（Uranyl acetate）等。这些染料对电子束有很强的散射作用，在TEM下显示出明显的暗色背景。
3. 吸附与干燥：染色剂溶液围绕并渗透进入样品内部，但不与样品发生化学反应，而是通过物理吸附形成一层包裹样品的高密度外壳。然后样品经过自然挥发或加速干燥，使染色剂固定在样品周围及可能的部分内部空隙中。
4. 电镜观察：在透射电镜下观察时，由于高电子密度的染色剂形成的背景区域对电子的吸收或散射能力较强，因此在图像上呈现为暗色；而样品因其较低的电子密度相对显得较为透明或亮色，从而与暗色背景形成鲜明对比，使得样品的轮廓和形态特征得以清晰显现。
1.样本量及寄送要求：
（1）液体样品提供至少100μl，并配置好合适的浓度（上机前直接滴加样品，不做稀释或浓缩），浓度、纯度对拍摄效果影响比较大；
（2）粉末样品30mg左右，并注明溶剂类型及配置比例；
（3）外泌体样品100μL，干冰运输寄送（不少于10kg干冰）；
（4）病毒要灭活后寄送，4℃运输寄送；
（5）细菌样品，4℃运输寄送。
2.样品注意运输方式，需要冰袋或者干冰运输的请提前说明，并附详细送检要求的预约单。
负染色的效果可能受到样本的运输时间影响，如需负染色，关于样本准备和测试安排，请提前与e测试工作人员沟通确认。
3.测试周期：一般为样品接收后的1周左右，如遇法定假期需要顺延，具体实验周期及送样时间请与e测试工作人员沟通确认，谢谢！
4.交付数据：每样提供10张拍摄图片（不提供分析服务）。如需更多照片请提前与e测试工作人员沟通确认，并且会产生额外费用，请悉知！结果反馈请在测试完成一周内，不建议回收样品，如有需要请提前反馈给e测试工作人员。
参考图
外泌体、蛋白等负染样本应该如何准备？
①样品悬液尽量纯化。如果杂质太多，如大量的细胞碎片，培养基残渣，糖类以及各种盐类结晶的存在都会干扰染色反应和电镜的观察。尤其是不能有过多的糖类，因为在电子束的轰击下，糖类容易碳化而有碍观察，因此样品要适当提纯。 ②液体样品提供100-200μl，提供合适的浓度（上机前直接滴加样品，不做稀释或浓缩）；粉末样品20mg左右，并告知配置比例。样品悬液的浓度要适中，太稀在电镜下很难找到样品，太浓样品堆积影响观察。 ③根据样品的保存条件，常温保存可直接寄送；4℃保存可以加2-3个冰袋寄送，冰袋一定不要直接接触样品管，用泡沫包裹样品，避免样品结冰，注意冰袋融化不要弄湿预约单、样品管上编号，编号需要按照送样单上的编号，尽量简化编号。 如果是外泌体样品，尽量是新鲜提取的样本（不能固定），加干冰寄送，干冰消耗量以每天7kg/d计算，保证足够量的干冰。
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