生物透射制样流程

一、简介

生物透射电镜是观察生物细胞样品内部形态的重要工具，其电压在80-120kv可以降低生物样品因高能电子束辐射而损伤的影响，同时依赖于生物样品制备技术的发展，如超薄切片技术、负染色技术、冷冻制样技术、细胞化学技术等，广泛应用于组织学、细胞学、病毒学、病理学及材料学等多个学科的研究中。

二、制样流程

1.取材及固定细胞/细菌、组织样本：细胞团要求至少半个绿豆大小。悬浮培养细胞/细菌，离心收集，弃去培养液，加入2.5%戊二醛，于4°C保存。对于贴壁细胞，先倒去培养液，加入2.5%戊二醛，4°C固定15min，用细胞刮刮下，离心收集（固定液保留），于4°C保存。组织样本，离体1-3min内取样，1mm3。如来不及修整组织大小可先于电镜固定液内固定半小时左右待组织变硬以后再修整组织进行后固定。超出此范围后组织会无法完全固定，后续实验无法完成，务必请重视此过程。固定时间：至少4个小时。

2.缓冲液冲洗：用0.1M磷酸漂洗液漂洗4次，每次15min；

3.后固定：用1%的饿酸•0.1M磷酸缓冲液（PH7.2）室温（20°C）固定2-4小时（固定时间因样品不同而适当调整）；

4.洗酸：使用PBS缓冲液漂洗3次，每次15min。

5.梯度脱水：  30%乙醇    15min

                      50%乙醇    15min

                      70%乙醇    15min

                      90%乙醇    15min

                     100%乙醇    20min    2次

                     100%丙酮    20min    2次

                   （含水量多、细胞膜厚的样品可适当延长脱水时间）。

6.渗透

                      丙酮：环氧树脂1：1    1h

                      丙酮：环氧树脂1：3    3h

                      纯环氧树脂                  12h

7.包埋

   将渗透好的样品放入胶囊或包埋板中，加入包埋剂环氧树脂，在 60℃度温箱中聚合 48 h。

8.超薄切片

  切片厚度：70 nm。

9.双染色

  铀铅双染色（2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，室温染色 15 min），切片室温干燥过夜。

  由于生物样品主要由碳、氢、氧、氮等轻元素组成。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其生物超薄切片被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身差别很小。因此生物样品超薄切片观察时像的反差极弱。为了提高图像的反差，要对超薄切片进行电子染色。这里所谓电子染色是根本不同于光学显微镜的染色，它是利用重金属盐（如铅盐、铀盐等）与细胞的某些成分或结构结合，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成分对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的。目前最常用的染色剂是醋酸铀和柠檬酸铅染色液。操作流程是：超薄切片先柠檬酸铅染色10分钟，去二氧化碳的双蒸水清洗3次，再用醋酸铀染色10-30分钟，双蒸水清洗3次，等超薄切片干燥后，即可上透射电镜观察。（百度搜索）

10.透射电镜观察。

二、制样视频

视频路径：钉钉云智商学院（付晓阳）