分子蛋白平台

qPCR检测

仪器型号

qPCR荧光定量仪,Western Blot,qpcr,美国-美国ABI-Quantstudio 6Flex(定量PCR仪),美国-赛默飞,QuantStudio 6 Flex等

预约次数:182
服务周期: 平均5-20个工作日
测试收费:沟通
详细介绍
 
项目介绍
 
1.简介
    在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。分为SYBRGreen法与TaqMan探针法。
    荧光染料法:实验设计简单(仅需2个引物,无需设计探针),初始成本低,灵敏度高,但需要进行熔解曲线分析检验扩增反应的特异性。适用于非特异性检测(专一性要求不高或高通量检测)。
    探针法:有高特异性(引物和探针共同于模板结合),高信噪比,能进行多重反应。但成本高,实验设计繁琐。适用于扩增序列专一检测。
2.服务流程
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样本要求
 
1. 送样要求
(1)A:细胞、细菌、真菌、动植物组织等均可寄送,为了保证实验要求,样品数尽可能准备充足。
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          注意事项
          1. 组织在1-2min内完成取材,速冻,并立即放入-80℃或液氮中保存。
          2. 有条件的话,最好先将样本在液氮中速冻,再转入-80℃冰箱中保存。
          3. 使用的冻存管最好也用DEPC处理。
          4. 对于组织及细胞样本,如果没有液氮或-80℃冰箱,也可用RNAlater保存,但是组织一定要切成比较小的块状,-20℃保存运输。
      B:细胞沉淀:细胞量大于10^6的细胞/组;细菌沉淀:细菌量大于10^8的细菌/组;
      C:土壤、污泥样本:至少10g;
      D:环境水样:至少1L/组,寄送装有过滤定量水样的滤膜(4°C),干燥寄送。 如果其他样品寄送需求,请与工作人员沟通确认!
(2)待测样品为RNA样品及cDNA样本,RNA浓度不低于200ng/uL,DNA浓度不低于20ng/uL,核酸体积10uL/检测基因,且样品接收后需先进行质检,质检合格的开展后续项目(核酸样本需包装完整,离心管用封口膜封闭,干冰寄送)。
(3)不接受具有致病性的样品。
(4)待测样品(原始样品或者RNA或者cDNA,原始样品可由我们代处理,RNA样品及cDNA样本接收后需先进行质检,质检合格的开展后续项目);
(5)提供所需的引物/标准品(或平台代设计及合成);提供检测基因的序列和引物序列,若基因序列来自文献等其他途径,可以多参考几组,避免引物特异性不足,延长实验周期。
(6)其他所涉及的细胞、试剂盒以及生物耗材等平台都可以有偿提供。
 
结果展示
 
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常见问题
 
question
1、熔解曲线出现双峰的原因?
引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
引物浓度不佳:适当降低引物的浓度,并注意上下游引物的浓度配比。
镁离子浓度过高:适当降低镁离子浓度,或选择更合适的 mix 试剂盒。
模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。
question
2、CT值出现太晚,偏大?
扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应;适当降低退火温度;增加镁离子浓度等。
PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。
question
3、阴性对照出现明显扩增
反应体系污染:更换新的Mix、ddH2O、引物重复实验。反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。
引物二聚体的出现:配合熔解曲线进行分析。
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