体外抗菌试验

　　一、项目介绍

　　体外条件下，用于测定抗菌药物或材料体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌试验，可以测定一个药物或材料的最低抑菌浓度，用以评价该药物或材料的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法：平板涂布计数、抑菌圈测试、OD值测试、MIC/MBC等。

　　1、平板涂布计数简介

　　将待测样品与菌液共培养后，取一定量的稀释样液涂布到平板上，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞;统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。通过与组内或者组间比较，从而得到样品对测试菌株的抗菌性能。

　　参照标准 ：

　　GBT 31402-2015 塑料 塑料表面抗菌性能试验方法

　　JCT 1054-2007 镀膜抗菌玻璃

　　GBT 20944.3-2008 纺织品抗菌性能的评价 第3部分震荡法

　　GBT 21510-2008 纳米无机材料抗菌性能检测方法

　　2、抑菌圈测试简介

　　抑菌圈法是衡量杀菌防霉剂效果的一种方式，主要用于测定杀菌防霉剂对细菌、霉菌、酵母菌的抑菌作用，是定性或半定量的方法。通过杀菌防霉剂在琼脂平板上的扩散能力来初步筛选更有效的杀菌防霉剂品种。主要方法：K-B法(Kirby-Bauer test)、打孔、牛津杯。

　　参照标准：

　　GB/T 39101-2020 多肽抗菌性测定 抑菌圈法

　　3、OD值测试

　　待测样品与菌液共培养后，细菌生长的培养液浊度与细菌浓度成正比，通过测试培养液的OD值来表征待测材料的抗菌效果。

　　4、MIC/MBC

　　最低抑菌浓度(MIC)：能够抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度;最小杀菌浓度(MBC)：能够杀灭培养基内细菌生长的最低药物浓度，杀死99.9%的供试微生物所需的最低药物浓度。MIC和MBC都可用来评价药物抑菌或者杀菌作用的强弱，数值越小，药物的作用越强。

　　参照标准：

　　GB/T27623.1-2011 渔用抗菌药物药效试验技术规范 第1部分:常量肉汤稀释法 药物敏感性试验

　　YY/T 0688.1-2008临床实验室检测和体外诊断系统　感染病原体敏感性试验与抗菌剂敏感性试验设备的性能评价

　　二、样品要求

　　1、平板涂布计数

　　a.块体类：薄膜、金属块、镀膜玻璃等(具备一定的表面积)。送样量：样本量为1个/次重复/种菌。样本尺寸：要求测试面积大于等于1.5×1.5cm，大于该面积按照比例添加菌液。

　　b.液体类：送样量根据测试时样本的溶剂和浓度而定，浓度由样品特性及实验目的而定，需要客户确定，一般不超过500ul(5ml菌液的10%)。

　　c.粉末类：送样量：需要提供样本与菌液的培养体系，比如X g样本/mL菌液，样本量为X g/次重复/种菌。若无相关参考，一般可提供5mg，用5ml菌液孵育24h，进行尝试。

　　2、抗菌圈测试

　　a.块体类：薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等

　　制样要求：金属块、凝胶类样本须制备成统一大小的圆形/方形，建议制备直径为6 mm圆形。布料、纸片类样本可代为裁剪，默认制备直径为6 mm。若样品太脆无法裁剪，可称取相应质量(一般100mg)材料，用1mlPBS浸泡12h，制备成药敏片，进行尝试，也可根据具体情况定制。

　　注：凝胶样本须保证样本在培养条件下(一般为37℃)不融化。

　　b.液体类：(需制备药敏片)

　　送样量：根据测试时样本浓度而定，一般为1 mL/种菌，如需稀释请告知稀释倍数，浓度若无相关参考，一般可采用1mg/ml 进行尝试。

　　c.粉末类：(需打孔)

　　打孔器打6 mm直径的孔，原则上需要粉末填充充满所打的孔，一般最少需要1g粉末样品。建议制作分散液，按照等体积加样(每个孔最大加样量为0.2 mL)。

　　3、OD值测试

　　a.块体类：薄膜、布料、金属块、纸片、凝胶等。送样量：由样品特性及实验目的而定，需要提供样本与菌液的培养体系。若无相关参考，一般采用96孔法，每个样品需要提供3mg进行尝试。

　　b.液体类(要求样本溶液无色或者淡色)。由样品特性及实验目的而定，需要客户确定，一般采用96孔法，若无相关参考，每个样品需要提供200ul，母液浓度一般1mg/ml，进行尝试。

　　4、MIC/MBC

　　粉末/液体类(要求样本溶液，完全溶解且无色或者淡色)-微孔板法 ;提供的粉末必须可溶，根据CLSI标准，最大母液浓度512ug/ml，如果不参照标准，则可自行定浓度。

　　三、结果展示

　　1、平板涂布计数

　　默认3个技术重复，结果为三个计数(含照片)和平均值。以大肠杆菌为例：

　　对照组 样品1

　　2、抗菌圈测试

　　结果反馈三个平板带抑菌圈和测量的抑菌圈，每个抑菌圈测量三次取平均值。

　　3、OD值测试

　　默认3个技术重复，即每个点交付3次OD值。

　　4、MIC

　　MIC结果为肉眼可见无细菌生长的最小浓度，默认三个重复(拍照一次)，最终告知哪个浓度无细菌生长(如下表)，也可扫OD 。

　　(注意：样品有颜色，OD值显示不准确，不建议扫OD)

　　注：-表示无细菌生长，+表示有细菌生长。

　　由测试结果可知，样品A的MIC为16μg/ml，对照诺氟沙星的MIC为2μg/ml，样品A的MBC为32μg/ml。

　　四、常见问题

　　1、培养基配置应注意的问题

　　1)灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量。

　　2)琼脂培养基不能反复溶化。反复溶化会破坏培养基中的营养成分。

　　3)培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏。

　　4)含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。

　　2、常规菌株需要设置抗生素对照组吗?

　　一般菌株为常规菌株，不耐药，做抗生素对照意义不大。

　　3、液体样品溶剂需要注意哪些?

　　溶剂为DMSO的液体样本，需注意纯的DMSO会杀菌的，建议溶剂DMSO低于5%，并做阴性对照。其他溶解可与工作人员联系。