细胞增殖及毒性检测实验原理

　　细胞毒性检测是生物相容性测试的一种，检测药物或者新型材料在生物环境中的毒性情况，即通过检测材料或者药物对细胞的增殖或者生长的影响，来评价药物或材料的毒性或者活性，主要用于药物活性筛选、细胞增殖/毒性测定、抗肿瘤药效计算IC50等;常用MTT法或者CCK8法检测，另外也可以通过Live/dead双染法进行细胞成像，更直观的记录细胞的存活情况。

　　细胞增殖及毒性检测实验原理

　　1.CCK-8测试

　　CCK-8试剂(Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂)中含有WST–8(2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(Formazan)，生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比，用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。注：贴壁细胞和悬浮细胞均可使用此方法，悬浮细胞CCK-8孵育时间应适当延长。

　　2.MTT测试

　　活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能;二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臢，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，使用多功能酶标仪在490nm处测定其吸光值，从而定量测定细胞的存活比例。

　　注：多用于贴壁细胞。

　　3、Live/Dead细胞染色

　　活/死细胞双染试剂盒可同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。该试剂盒包含钙黄绿素-AM和碘化丙啶(PI)两种溶液，分别用于染色活细胞和死细胞。其中钙黄绿素-AM，即钙黄绿素的乙酰羟甲基酯，具有高度亲脂性和细胞膜透过性。尽管钙黄绿素-AM自身并非荧光分子，但活细胞中的酯酶可以催化钙黄绿素-AM生成钙黄绿素，从而发出强烈的绿色荧光(λex 490 nm, λem 515 nm). 因此钙黄绿素-AM只能染色活细胞。而核染色染料PI不能透过活细胞的细胞膜。但可以透过死细胞膜的变性区域来到达细胞核，并与细胞中的DNA双螺旋结构结合，从而发出红色荧光(λex 535 nm, λem 617 nm)。钙黄绿素和PI-DNA都能被490nm波长的光激发，因此可以采用荧光显微镜同时监测活细胞和死细胞。使用λex激发光时只能观察到死亡细胞。