生物透射电镜之负染色技术制样步骤

　　负染色技术是一种制备电子显微镜样品图像呈现复反差的技术。用于观察样品中的颗粒性物质或生物大分子。用金属盐对铺展在载网上的样品进行染色，使整个载网都铺上一层重金属盐，而有凸出颗粒的地方则没有染料沉积。染色后，在电镜下观察时，被观察的对象为亮的，背景为暗的。负染色是只染背景而不染样品，与光学显微镜样品的染色正好相反。目前最常用的负染液是醋酸铀或者磷钨酸。

　　制样步骤

　　常用的负染制样方法有混合法、悬滴法、漂浮法等，本实验室常用的是悬滴制样法，具体制样流程如下：

　　1、样品准备：首先，将稀释后的生物样品滴在载网上，通常是涂布在一个网格状的铜或镍网上的小洞(也称井)内。

　　2、负染色剂添加：随后迅速滴加一种高电子密度的染色剂，如磷钨酸、醋酸铀等。这些染料对电子束有很强的散射作用，在TEM下显示出明显的暗色背景。

　　3、吸附与干燥：染色剂溶液围绕并渗透进入样品内部，但不与样品发生化学反应，而是通过物理吸附形成一层包裹样品的高密度外壳。然后样品经过自然挥发或加速干燥，使染色剂固定在样品周围及可能的部分内部空隙中。

　　4、电镜观察：在透射电镜下观察时，由于高电子密度的染色剂形成的背景区域对电子的吸收或散射能力较强，因此在图像上呈现为暗色;而样品因其较低的电子密度相对显得较为透明或亮色，从而与暗色背景形成鲜明对比，使得样品的轮廓和形态特征得以清晰显现。