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细胞内细胞因子染色法

更新时间:2024-07-22 点击次数:0 所属栏目:行业信息

  细胞内细胞因子染色(Intracellular Cytokine Staining, ICS)是一种常用的技术,用于检测和定量活化免疫细胞(如T细胞,NK细胞等)分泌的细胞因子。这种方法特别有用,因为它能够分析单个细胞水平上的细胞因子表达,而不仅仅是细胞培养上清液中的总细胞因子水平。以下是进行细胞内细胞因子染色的一般步骤:

  实验前准备

  刺激剂选择:根据研究目的选择适当的刺激剂,如PHA、PMA/ionomycin、抗原肽或病毒感染等,以激活细胞并促进细胞因子的产生。

  蛋白运输抑制剂:使用如Brefeldin A或Monensin等蛋白运输抑制剂阻止细胞因子从高尔基体向细胞外分泌,从而使得细胞因子积累在细胞内。

  实验步骤

  细胞培养:收集待分析的细胞,调整至适当密度,并将其与选择的刺激剂一起培养一定时间(通常是几小时到半天),同时加入蛋白运输抑制剂。

  表面标记:在固定和渗透之前,如果需要分析细胞表面标志物(如CD4、CD8等),则先用相应的荧光抗体对细胞表面进行染色。

  固定和渗透:使用固定剂(如甲醛或paraformaldehyde)固定细胞结构,然后使用渗透剂(如saponin或Triton X-100)使细胞膜变得多孔,以便抗体进入细胞内。

  细胞内染色:在固定和渗透后的细胞中加入针对细胞因子的特异性荧光抗体,通常是在室温或4°C孵育一段时间,以确保抗体能与细胞内的细胞因子结合。

  洗涤和重悬:去除未结合的抗体,将细胞重新悬浮在PBS或其他适合的缓冲液中,准备流式细胞仪分析。

  流式细胞术分析:使用流式细胞仪检测荧光信号,通过设置适当的门控策略来识别和量化表达特定细胞因子的细胞。

  数据分析

  对于每个样品,计算出产生特定细胞因子的细胞百分比或平均荧光强度(MFI)。

  与未经刺激的对照组比较,评估刺激效果。

  注意事项

  确保所有操作都在无菌条件下进行,以避免污染。

  使用同型对照抗体进行背景信号的控制。

  调整流式细胞仪的设置以优化信号和减少背景噪音。

  细胞内细胞因子染色法是研究免疫细胞功能和疾病机理的重要工具,尤其是在疫苗开发、自身免疫性疾病和感染性疾病的研究中。

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